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標簽蛋白有哪些?如何選擇標簽蛋白?蛋白質的檢測在生物科學研究中占據著至關重要的地位。其中,免疫分析方法被廣泛應用,包括WesternBlot、酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和免疫沉淀法(IP)等。這些方法依賴于抗原-抗體間的特異性反應,通過注射目標蛋白作為抗原至動物體內,產生免疫反應后分離抗體,進而進行檢測。盡管應用廣泛,但這種方法的缺點在于每次更換目標蛋白時都需要制備對應的抗體,操作繁瑣且成本高昂。融合標簽技術的出現為蛋白質免疫分析帶來了通用化和便利化。通過將特定的標簽與目標蛋白融合,兩者實現共同表達。通過對融合標簽的檢測,我們可以了解目標蛋白的表達情況。這種蛋白標簽技術利用基因克隆手段,將具有特定功能的多肽、蛋白質結構域甚至完整蛋白質與目標蛋白結合,廣泛應用于目標蛋白的表達、純化、檢測和示蹤等方面。經過長期研究,已經發展出一些成熟的檢測標簽技術。這些標簽不僅簡化了實驗操作,降低了成本,而且為蛋白質研究提供了強有力的工具。下面就挑幾個來介紹一下:①His-tagHis標簽是當前最為熱門的標簽蛋白之一。His6是指六個組氨酸殘基組成的融合標簽(HHHHHH),可插入在目的蛋白的C末端或N末端。當某一個標簽的使用,一是能構成表位利于純化和檢測;二是構成獨特的結構特征(結合配體)利于純化。組氨酸殘基側鏈與固態的鎳有強烈的吸引力,可用于固定化金屬螯合層析(IMAC),對重組蛋白進行分離純化。②Flag-tagFlag標簽蛋白為編碼8個氨基酸的親水性多肽(DYKDDDDK),同時載體中構建的Kozak序列使得帶有FLAG的融合蛋白在真核表達系統中表達效率更高。③AviTag是一個15個氨基酸的短肽,具有一個單生物素化賴氨酸位點,與已知天然可生物素化序列完全不同,可以加在目標蛋白的N端和C端。融合表達后,可被生物素連接酶生物素化,為了純化重組蛋白選用低親和性的單體抗生物素蛋白或抗生物素蛋白衍生物,除了用于蛋白質分離純化,還用于蛋白質相互作用研究。④SNAP-TagSNAP-Tag是從人的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移(O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase)獲得。SNAP所帶的活性巰基位點接受了苯甲基鳥嘌呤所攜帶的側鏈苯甲基基團,釋放出了鳥嘌呤。這種新的硫醚鍵共價結合使SNAP所帶的目的蛋白攜帶上了苯甲基基團所帶的標記物。檢測:生物素或各種顏色熒光的底物(如熒光素、若丹明)可滲透進入細胞,方便快捷地進行活細胞內SNAP-Tag融合蛋白的標記與檢測。它們也可特異性地標記大腸桿菌,酵母和哺乳動物等細胞抽提液或已經純化的蛋白液中的SNAP-tag融合蛋白。⑤GST(谷胱甘肽巰基轉移酶)GST標簽蛋白本身是一個在解毒過程中起到重要作用的轉移酶,它的天然大小為26KD。GST融合表達系統廣泛應用于各種融合蛋白的表達,可以在大腸桿菌和酵母菌等宿主細胞中表達。結合的融合蛋白在非變性條件下用10mM還原型谷胱甘肽洗脫。GST標簽可用酶學分析或免疫分析很方便的檢測。標簽有助于保護重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解并提高其穩定性。純化:該表達系統表達的GST標簽蛋白可直接從細菌裂解液中利用含有還原型谷胱甘肽瓊脂糖凝膠親和樹脂進行純化。如果要去除GST融合部分,可用位點特異性蛋白酶切除。⑥GFPGFP(綠色螢光蛋白)是由下村修等人在水母中發現的。它在藍色波長范圍的光線激發下,會發出綠色螢光。GFP標簽可位于蛋白質的C端或N端,該系統已廣泛應用于各種細胞類型,包括細菌、酵母和哺乳動物細胞等,相應的GFP標簽抗體也被廣泛應用。GFP在檢測蛋白表達、蛋白和細胞熒光示蹤、研究蛋白質之間相互作用和構象變化中,起到了重要的作用。該如何選擇表達克隆的標簽1、首先,需要確定融合標簽的目的蛋白純化:標簽的普遍用途是蛋白純化。小分子6XHisTag常被用于細胞內源蛋白的純化。6XHisTag也廣泛應用于大腸桿菌的蛋白純化??墒遣溉閯游锛毎幸蚍欠置诘鞍鬃陨泶嬖诟呓M氨酸背景,因此極少使用6XHisTag。WesternBlot檢測:若需要做WesternBlot實驗來檢測細胞裂解物中蛋白的表達,你可以選擇有匹配的抗體的小分子標簽。FLAG?Tag以其分子量小以及擁有許多與之匹配的商業化的抗體等優勢,成為WesternBlot實驗中常用的Tag。免疫沉淀反應:FLAG?Tag其分子量小以及擁有大量相匹配的商業用抗體等優勢成為免疫沉淀反應中最常用的Tag.其他常用的標簽有:HA和cMyc.免疫共沉淀。首先,裂解您的樣本,以釋放蛋白。向試管中添加裂解液的同時,加入靶向融合標簽的抗體,抗體會識別融合標簽。然后抗體與蛋白A或G偶聯微珠結合,后者拉出您的目標蛋白,以及與之復合的其他蛋白?;罴毎上瘢簾晒獾鞍祝‵luorescentProteins,FPs)是活細胞成像常用的標記蛋白。其中最常用的是綠色熒光蛋白(GFP)和它的衍生物(CFP,YFP,etc.),以及一些紅色變體,如dTomato和mCherry.2、考慮融合標簽的影響任何一類標簽處于氨基酸序列的任一位置,都具有影響目的蛋白表達或功能的可能性。最主要原因是標簽可能會干擾蛋白的正確折疊,致使目的蛋白失活或形成包涵體。其次,標簽可能會中斷亞細胞定位信號,這種情況下,蛋白能夠正確翻譯和折疊,但在細胞內所處的位置是錯誤的。因此,您需要知道添加的標簽對目的蛋白的表達是否有影響。3、考慮是在N-端還是C-端標記N-端或C-端標記的選擇還需要根據蛋白結構、定位等特性。然而,倘若你沒有確切的蛋白結構,或蛋白功能域圖譜,建議分別構建N

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